一、蛋白表达量低：

1.充分了解研究的蛋白，表达量低适当增加上样量，20-50μg。

2.本底表达还是诱导表达，非特异性条带。

3.样本提取蛋白使用蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂，并设置对照，避免蛋白降解。

4.检查一抗特异性是否适合目的蛋白的种属，看说明书，一抗二抗最好买经过验证的。

二、蛋白转膜效率低：

1.可以丽春红染色检查转膜效率,分子量小的蛋白，注意用小孔茎的膜。

2.适当调整优化转膜的时间和电流。

3.分子量表达低的选择超敏的发光液。

有阳性条带，但条带比较弱

1.抗体染色不充分：增加抗体浓度，延长孵育时间。

2.酶活性降低：直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。

3.标本中靶蛋白含量太低：增加标本上样量。

4.洗膜过度：缩短洗涤时间。

5.HRP 抑制剂：所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。

6.抗体活性降低：选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置。

7.封闭过度：减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型。

8.曝光时间过短：延长曝光时间。

9.HRP 抑制剂：所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。

背景高

1.上样量多：适当减少上样量。

2.洗膜不充分：增加洗液体积和洗涤次数，原则可以快洗慢孵育。

3. 阻断不充分：选择合适的封闭试剂，增加封闭液孵育时间，封闭浓度。洗涤液中加入 Tween-20 可减少交叉反应。脱脂奶粉含有的酪蛋白是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。使用 BSA 代替奶粉作为封闭剂。

4.抗体过多：降低抗体浓度，使用单抗，减少二抗孵育时间

5.检测过程中膜干燥：保证充分的反应液，避免出现干膜现象。

6.曝光过度：缩短曝光时间。

7.蛋白降解：使用新鲜样本，加入蛋白酶抑制剂，在冰上操作。

8.膜的选择导致的高背景：用低背景的NC 膜替换高背景的PVDF 膜。

9.蛋白存在不同的剪切形式：查阅数据库文献，了解蛋白的特异性一抗。

非特异性条带或蛋白条带大小不对

1.蛋白降解：加入蛋白酶抑制剂，样本处理时在冰上操作。

2.目的蛋白有多个亚型，分子量都不同：查阅文献或数据库，了解目的蛋白的信息。

3.细胞系传代次数过多：选择传代少的原代细胞系进行样品制备。

4.目的蛋白具有多种修饰形式，如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等，查阅文献或数据库分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，确定该蛋白是否存在不同长度的编码mRNA。

5.蛋白有聚合体，如二聚体、四聚体和多聚体：SDS-PAGE 电泳上样前煮沸 10 min以增强蛋白质解聚变性。

6.上样量过高或抗体浓度过高：适当减少上样量和抗体浓度。

7.洗涤不充分

8.一抗特异性不高：重新选择或制备高特异性的抗体

条带弯曲，拖尾等不同条带问题

蛋白转印效率低

分子量大的蛋白

1.甲醇浓度太高：降低甲醇浓度至 10%（V/V）以下。

2.蛋白结合时间不够：使用湿转代替半干转。延长转印时间。

3.蛋白凝胶浓度太高：降低凝胶浓度，转印 buffer 中添加 0.1%SDS，促进蛋白溶解。

分子量小的蛋白

1.小蛋白在膜上结合量少：使用蛋白结合能力更强的膜。增大 SDS-PAGE 凝胶浓度。

2.使用小孔径印迹膜，如 0.1μm 或 0.2 μm Protran 印迹膜。

3.转印 buffer 中残留的 SDS 影响蛋白与膜的结合：转印 buffer 中不要有 SDS。转印前凝胶与转印 buffer 平衡至少 15min 以上。

4.转印 buffer 中甲醇浓度太低：提高甲醇的浓度（15%-20%）

5.蛋白结合时间不够：调低电压，延长转印时间。

分子量很小的蛋白质＜20KD，选择什么膜？

1）可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系；

2）也可以选择PSQ 膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。

显影时，底片漆黑一片，是为什么？

1） 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作，看是否有改善。

2）显影时间过长，一般3-5分钟就够了，特殊情况需摸索显色时间。

膜上出现反像

可能二抗偶联HRP的浓度过高，可适当降低二抗的浓度。

WB实验选择“丽春红”还是“考马斯亮蓝”染料？

Ponceau S 检测到的蛋白质水平为 200 ng 以上，与 PVDF、硝化纤维或尼龙膜兼容。考马斯亮蓝仅与 PVDF 膜兼容，但可以检测 50 ng 及以上的蛋白质。建议检测 50-200 ng 范围内的蛋白质，选择考马斯亮蓝。但是，在 CST，我们通常首选Ponceau S，因为它速度快、易用、柔和而有效。

Western Blot“淬灭”？

1.含HRP的抗体：抗体方面来说，可以采用适当降低抗体的浓度，发光实验时快速操作来解决“淬灭”的问题

2.发光液：可以选用发光稳定的ECL发光液来解决“淬灭”的问题。

如何选择蛋白Marker？

1.根据蛋白Marker分子量范围：尽可能选择分子量范围比较广的蛋白marker，以便适用于更多蛋白的检测。如果已经确定集中在大分子量蛋白或小分子量蛋白的检测，最好选择对应分子量范围的marker，以便获得更好的指示。

2.考虑使用预染蛋白Marker：因为预染Marker在电泳或转膜过程中可以被直接观察到，方便我们判断电泳的进程，如电泳是否发生异常或是否将目标蛋白完全分开等，也可以判断转膜的是否完全，转膜后还可以直接在膜上标记蛋白分子量。

3.考虑Marker条带数是否在分子量范围内分布均匀，没有广泛的空白区域。是否多种颜色，以便于快速识别不同的分子量大小。此外，五颜六色的Marker也为实验结果添加一抹亮色。还要注意选择条带锐利清晰的Marker，这样才能更精确的指示蛋白的分子量。

WB实验中如何正确设置内参？

1.根据实验样本的种属选择适合的内参。如哺乳动物组织或细胞通常用β-actin，GAPDH等，植物样本，可以选用Plant actin、Rubisco等。

2.根据目的蛋白的表达位置选择合适的内参。如要检测全细胞或细胞质中的蛋白表达，可以选择β-actin，GAPDH和β-Tubulin作为内参，如要检测细胞核中的蛋白，可以选用PCNA和TBP作为内参，线粒体蛋白的内参选择COX IV、VDAC1/Porin，胞膜蛋白内参Na+/K+-ATPase 等。

3.一般选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上，以防止条带互相影响。

免疫组化和WB两个试验的一抗和二抗可以共用吗？

免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；WB可以特异性检测某个蛋白质分子，如抗体选择合适，灵敏度很高。WB进行定量，但是不能定位。

两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。

同一蛋白样品能同时进行两种因子的WB检测吗？

可以，有时如果抗体特异性高且效价高，同时使用2种一抗，可在一张膜上检测2种不同蛋白。

膜蛋白或胞浆蛋白，WB操作需要注意什么？

如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂要温和得多，需要加上NaF去抑制磷酸化酶的活性，推荐使用商业化的混合抑制剂。